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血液系統(tǒng)惡性腫瘤(HM）是一組包括白血病、淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤等在內(nèi)的造血系統(tǒng)疾病，具有惡性程度高、治療復(fù)雜、預(yù)后差等特點(diǎn)。免疫組庫測序在微小殘留病灶（MRD）監(jiān)測和克隆演變方面的研究逐漸增多，可輔助評估腫瘤治療效果，并動態(tài)監(jiān)測腫瘤的早期復(fù)發(fā)。
《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南（2020年修訂）》指出“微小殘留?。∕inimal Residual Disease, MRD）水平對MM預(yù)后有明顯影響。”此外，在多篇臨床指南與專家共識中均提出MRD檢測可以輔助急性髓系白血病、多發(fā)性骨髓的臨床治療方案制定與患者的預(yù)后監(jiān)測，具有重要的臨床價(jià)值。
熙寧|精翰生物攜手泛因醫(yī)學(xué)，
開展血液瘤MRD檢測
MRD是指惡性腫瘤經(jīng)過治療后體內(nèi)殘留的微量腫瘤細(xì)胞的狀態(tài)。正常淋巴細(xì)胞未受任何刺激情況下，其基因重排是隨機(jī)的，細(xì)胞表現(xiàn)為多家族和多克隆性，具有發(fā)揮各種細(xì)胞免疫作用的潛能。而在淋巴細(xì)胞白血病或淋巴瘤發(fā)生過程中，某一種或幾種淋巴細(xì)胞發(fā)生異常增殖，這些異常增殖的淋巴細(xì)胞攜帶相同的TCR或BCR，導(dǎo)致TCR或Ig基因單克隆性表達(dá)，導(dǎo)致在淋巴結(jié)、外周血或者骨髓細(xì)胞中出現(xiàn)1個(gè)或2個(gè)主要淋巴細(xì)胞克隆。檢測MRD能夠準(zhǔn)確獲取體內(nèi)殘留腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，有助于對療效進(jìn)行評估，提前發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)趨勢。
泛因醫(yī)學(xué)NEO-MRD?檢測通過精準(zhǔn)地分析腫瘤細(xì)胞特異性標(biāo)簽，并跟蹤定量患者治療后的微小殘留腫瘤細(xì)胞數(shù)量；同時(shí)評估腫瘤細(xì)胞是否發(fā)生了進(jìn)化從而保證結(jié)果的準(zhǔn)確性；還可以對機(jī)體免疫力進(jìn)行監(jiān)測。是國內(nèi)首個(gè)獲得歐盟CE認(rèn)證的血液腫瘤MRD檢測產(chǎn)品，NEO-具備檢出率高、準(zhǔn)確率高、自動化等特點(diǎn)，能夠極大助力全球血液腫瘤微小殘留病行業(yè)發(fā)展。
熙寧的血液瘤MRD檢測經(jīng)性能驗(yàn)證，確認(rèn)靈敏度、特異性、精密度和穩(wěn)定性等，均滿足要求，性能可靠穩(wěn)定，靈敏度可達(dá)10‐6，該檢測項(xiàng)目的落地進(jìn)一步強(qiáng)化公司檢測分析一體化布局，可給申辦方血液腫瘤藥物臨床研究開展提供完整的檢測分析方案。
TCR/Ig編碼基因是識別
不同T/B細(xì)胞的標(biāo)志物
免疫組庫（immunerepertoire, IR）是樣品中TCR/Ig編碼基因的總和。免疫組庫測序（IR-seq）是對DNA或RNA樣品中的TCR/Ig基因進(jìn)行富集和測序。MRD的水平一般比較低，需要用敏感性和特異性都非常高的方法來進(jìn)行檢測。高靈敏度二代測序（NGS）MRD檢測方法，其靈敏度可達(dá)1×10‐6，比標(biāo)準(zhǔn)MFC或PCR檢測方法更靈敏。
TCR為所有T細(xì)胞表面的特征性標(biāo)志，以非共價(jià)鍵與CD3結(jié)合，形成TCR—CD3復(fù)合物。TCR的作用是識別抗原。TCR是由兩條不同肽鏈構(gòu)成的異二聚體，由α、β兩條肽鏈組成，每條肽鏈又可分為可變區(qū)（V區(qū)），恒定區(qū)（C區(qū)），跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)等幾部分；其特點(diǎn)是胞質(zhì)區(qū)很短。TCR分子屬于免疫球蛋白超家族，其抗原特異性存在于V區(qū)；V區(qū)（Vα、Vβ）又各有三個(gè)高變區(qū)CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3變異最大，直接決定了TCR的抗原結(jié)合特異性。在TCR識別MHC-抗原肽復(fù)合體時(shí)，CDR1、CDR2識別和結(jié)合MHC分子抗原結(jié)合槽的側(cè)壁，而CDR3直接與抗原肽相結(jié)合。TCR分為兩類：TCR1和TCR2；TCR1由γ和δ兩條鏈組成，TCR2由α和β兩條鏈組成。外周血中，90%-95%的T細(xì)胞表達(dá)TCR2；而且任一T細(xì)胞只表達(dá)TCR2和TCR1之一。
B細(xì)胞抗原受體(B-Cell Receptor, BCR)是一種位于B細(xì)胞表面的負(fù)責(zé)特異性識別及結(jié)合抗原的分子，其本質(zhì)是一種膜表面免疫球蛋白(Membrane Lmmunoglobulin, MIg)。BCR具有抗原結(jié)合特異性，每個(gè)個(gè)體的BCR多樣性高達(dá)5x10-13，構(gòu)成容量巨大的BCR庫，賦予個(gè)體識別各種抗原、產(chǎn)生特異性抗體的巨大潛能。在成熟B細(xì)胞表面，BCR總是和負(fù)責(zé)傳遞抗原刺激信號的Igα/Igβ(CD79a/b)異二聚體共同表達(dá)，形成BCR-Igα/Igβ復(fù)合體(BCR復(fù)合物)。編碼重鏈基因的的染色體包括4種DNA元件(基因片段)，分別是V、D、J、C。在人類B細(xì)胞中，V片段大約有50種，D片段大約有20種，J片段大約有6種，C片段大約有10種。而每個(gè)特異B細(xì)胞就是通過基因重排，選擇每類片段中的一種，并將它們組合在一起，以組裝成一個(gè)成熟的H-chain基因。
引物設(shè)計(jì)
準(zhǔn)確靈敏的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。該系統(tǒng)是基于準(zhǔn)確無偏的Ig/TCR多重PCR實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行腫瘤克隆鑒定和MRD檢測的。在多重PCR中不同引物擴(kuò)增效率的差異會帶來擴(kuò)增偏差，通過實(shí)驗(yàn)技術(shù)及數(shù)據(jù)處理算法的持續(xù)研發(fā)，該MRD檢測方法將引物擴(kuò)增效率優(yōu)化至十分均衡，而均衡的擴(kuò)增系統(tǒng)將帶來MRD定量的高準(zhǔn)確度和高靈敏度。
擴(kuò)增多條受體鏈提高腫瘤細(xì)胞的檢出率。實(shí)驗(yàn)體系包括IGH、IGK、IGL、TRB、TRD、TRG的受體鏈，可以準(zhǔn)確的鑒定腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志序列，同時(shí)每條鏈還包括不同位置（FR1、FR2、FR3）的引物，可以有效的避免由于腫瘤細(xì)胞的突變引起的假陰性或定量不準(zhǔn)確。
數(shù)據(jù)分析
MRD數(shù)據(jù)分析流程示意圖
MRD的數(shù)據(jù)分析流程基于IMonitor開發(fā)，包括免疫數(shù)據(jù)庫比對、頻率文件重構(gòu)、測序錯(cuò)誤糾正、生成excel結(jié)果、生成pdf報(bào)告。具體執(zhí)行由圖所示，將原始的雙端測序數(shù)據(jù)合并，并分別與IMGT數(shù)據(jù)庫的V/D/J參考序列進(jìn)行比對，識別CDR3結(jié)構(gòu)，統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)。結(jié)果spike in序列估計(jì)樣本總有核細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算MRD值。根據(jù)已檢測的數(shù)據(jù)庫中是否存在受檢者編號，決定該受檢者為首次檢測或追蹤檢測，針對首次檢測的患者鑒定異常高頻克隆并繪制異常高頻克隆頻數(shù)分布圖，針對追蹤檢測患者繪制異常高頻克隆追蹤折線圖，并生成pdf報(bào)告。
檢測局限
（1）檢測的靈敏度受樣品體積和細(xì)胞數(shù)的直接影響，當(dāng)MRD水平較低時(shí)，送檢細(xì)胞數(shù)量太少可能會導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。
（2）由于檢測原理和方法的差異，不同方法檢測的MRD水平可能有一定差異。
（3）樣品類型、采樣時(shí)間和位置的不同，檢測結(jié)果可能會有所不同，尤其當(dāng)MRD水平比較低的時(shí)候。
（4）樣品污染、技術(shù)和生物學(xué)因素有可能導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性和假陰性。
分析示例
對上述患者進(jìn)行首次克隆鑒定，根據(jù)圖示結(jié)果可知，檢測到3條異常高頻克隆，包括2條IGH及1條IGK，克隆頻率分別為58.85%、31.45%、72.21%，有核細(xì)胞占比均超過0.2%，呈斷層式分布，符合異常高頻克隆的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)該患者進(jìn)行術(shù)后追蹤檢測時(shí)，其克隆鑒定/MRD分析結(jié)果如下：
由圖可知，送檢標(biāo)本中檢測到腫瘤殘留的克隆，殘留水平為100萬個(gè)有核細(xì)胞中有33080個(gè)腫瘤細(xì)胞，為臨床診斷及腫瘤復(fù)發(fā)評估提供指導(dǎo)意義。
總結(jié)
熙寧生物（精翰生物）整體業(yè)務(wù)中涵蓋了細(xì)胞治療、基因治療、單雙抗和一些新型藥物的臨床檢測。在細(xì)胞治療業(yè)務(wù)中，絕大多數(shù)為血液瘤，因此，血液瘤MRD的檢測方法的建立也是必不可少的。NEOMRD?可以評估MRD水平，同時(shí)監(jiān)測是否有腫瘤克隆的演化克隆或新的高頻克隆出現(xiàn)，評估由于原腫瘤克隆的演化克隆或亞克隆導(dǎo)致的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，對疾病預(yù)后具有臨床指導(dǎo)意義。
參考文獻(xiàn)
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