中文
前言
基因治療的概念是在20世紀70年代初提出來的，最初的概念是引入一個正常的基因來取代一個突變基因，雖然現在有更多的替代方法，如基因編輯和堿基編輯，但它仍然是精翰生物高度依賴的主要策略之一。
基因治療按照基因導入后的細胞培養(yǎng)模式可以分為“離體治療”和“體內治療”。“離體治療”的操作對象是從病人身上分離的細胞，然后在體外經過改造和擴增再回輸到體內達到治療的效果，例如CAR-T治療等。“體內治療”操作時只需要把攜帶目的基因的病毒載體注入病變部位即可，理論上可以實現任意種類細胞的基因改造，不再像“離體治療”那樣受到細胞種類的限制，這是“體內治療”相對“離體治療”最大的優(yōu)勢，但在技術上真正實現任意細胞的基因改造目前還有一定難度，例如AAV病毒載體基因治療。此外，“體內治療”也省去了“離體治療”的細胞收集、基因改造、培養(yǎng)擴增等繁瑣的操作。
以AAV為載體的基因治療藥物在產品CMC階段、臨床前和臨床階段都會用到各種各樣的生物分析手段。不同技術平臺對AAV為載體的基因治療藥物提供了不同解決方案。
難點分析1：AAV基因治療產品在CMC階段需要考察多種質量屬性，包括鑒別、含量/效價、純度、雜質和安全性等多個方面。其中，含量和效價是最大的難點。精翰生物團隊對基因組滴度、感染性實驗都具有豐富經驗。尤其在病毒滴度方面，開發(fā)出針對多種血清型的AAV基因組拷貝數滴度的定量檢測方案，滿足滴度測定的同時，也能考察病毒完整性。
精翰生物利用Naica數字PCR技術對重組腺相關病毒(rAAV)質粒載體和病毒基因組中ITR（CY5標記）、目的基因（GOI，HEX標記）和轉錄相關調控元件WPRE（FAM標記）三個不同基因位點同時拷貝數定量的方法進行優(yōu)化，在數據分析中對不同病毒樣品的前處理方案的條件進行闡述和比較，發(fā)現病毒樣品的前處理方案中ITR發(fā)卡結構的線性化和衣殼蛋白的裂解條件對病毒基因組拷貝數定量的精確性影響尤為重要，為數字PCR方法在基因治療病毒載體的質量控制體系中建立標準的檢測方法提供依據。
Fig1、cdPCR檢測WPRE/GOI/ITR 三靶標1D散點圖
A圖顯示WPRE檢測的1D散點圖，B圖顯示GOI檢測的1D散點圖，C圖顯示Msp I酶切處理前ITR檢測的1D散點圖，D圖顯示Msp I酶切處理后ITR檢測的1D散點圖，藍色表示WPRE陽性微滴群，綠色表示EGFP陽性微滴群，紅色表示ITR陽性微滴群，灰色表示陰性微滴群。當WPRE或GOI比ITR越接近1：2，則產品的基因組更完整。
難點分析2：AAV基因治療在臨床前的組織分布和臨床階段的脫落研究?；谒幬镞M入體內后會進入各器官，根據作用機理和治療目的，在臨床前研究組織分布，可以預測藥物安全性，并指導臨床方案。臨床階段的脫落分析將通過對患者給藥后的排泄物進行測定。通常會包括熒光定量PCR反應和傳染性試驗開展。
精翰生物具有多款基因治療藥物，包括溶瘤病毒和不同血清型AAV基因治療藥物的臨床前組織分布和臨床階段脫落研究經驗。使用熒光定量PCR開展這兩項檢測時，需要合成特異性強和靈敏度高的引物和探針。多種組織樣品和代謝物樣品的DNA提取過程中可能會引物一些PCR抑制物，抽提過程中產物量的差異性都需考量。
Fig2、精翰生物在PK/脫落研究中的流程圖
難點分析3：免疫原性是影響AAV基因治療產品安全性和有效性的重要因素。AAV基因治療在免疫原性的評估過程中不僅需要考慮體液免疫，還需要考慮細胞免疫。體液免疫檢測內容可以為：抗衣殼蛋白抗體/中和抗體和抗表達產物抗體。使用的分析方法通常為LBA或者cell based assay。細胞免疫檢測內容可以為：針對衣殼蛋白T細胞應答或針對表達產物抗體T細胞應答。無論是體液免疫還是細胞免疫，精翰生物擁有不同策略所開發(fā)的方法學和檢測設備。同時利用完善的方法學可以開展在臨床前研發(fā)階段，AAV衣殼蛋白改造后臨床前免疫原性評估。
精翰生物使用ELISPOT平臺，已經開發(fā)和驗證了基于ELISPOT技術檢測人PBMC經CEF刺激后分泌IFN-γ的免疫細胞數的方法學，建立了較為完善的方法學開發(fā)驗證體系。同時，正在開展了不同血清型AAV刺激PBMC后分泌INF-γ的免疫細胞數的方法學開發(fā)工作，根據AAV病毒載體血清型的不同，設計更具特異性方法學開發(fā)路徑和驗證方案。
Fig3、精翰生物在ELISPOT細胞免疫上的應用
1.選擇合適的刺激物和免疫細胞（PBMC, B細胞, T細胞）作用加入ELISPOT板中。2. 培養(yǎng)孵育一段時間，使激活的免疫細胞分泌細胞因子。3. ELISPOT板已包被抗細胞因子的抗體，可以捕獲在激活的免疫細胞周圍分泌細胞因子。4.洗板去除細胞，加入二抗反應，酶聯顯色，激活的免疫細胞會形成較為規(guī)則的圓形斑點。
精翰生物擁有不同檢測平臺和技術手段，2022年中，熙寧I精翰搭建起了二代測序平臺。精翰生物擁有設計合理、設施完備的獨立的高通量測序實驗室。實驗室設計遵循高通量測序的具體檢測流程和防治污染的原理。實驗包括一個專用走廊，分區(qū)設計依次為試劑準備間、標本制備區(qū)、擴增一區(qū)、雜交捕獲區(qū)/擴增二區(qū)、測序間和電泳間。實驗室設備齊全且經過合理驗證，目前實驗室儀器有TC-96/G/H(b)B（基因擴增儀）、QuantStudio 5 Real-Time PCR Instrument （QuantStudioTM 5實時定量PCR儀）、Agilent 4150（片段分析儀）、Covaris M220（核酸打斷儀）、E-Gel Power Snap（凝膠電泳系統）、Qubit（熒光計）、NanoPhotometer N60 Touch（超微量分光光度計）等，全面滿足高通量測序實驗需求。也為AAV基因治療藥物在CMC、臨床前和臨床階段提供了更完善的服務需求。
